Trong lúc Đại Việt đạt đến đỉnh cao của sức mạnh chính trị, quân sự và văn hóa trong ba thập niên cuối cùng của thế kỷ XV, dưới triều Hồng Đức, nhà Lê (1470-1497), thì thời kỳ đầu thế kỷ XVI chứng kiến sự suy yếu thảm hại của sức mạnh và sự cố kết nội tại của nó. Bắt đầu vào năm 1509, triều đình nhà Lê đã chứng kiến sự kế tục nhau của những ông vua bất tài và nhu nhược, bị nhiều người xa lánh tại triều đình và không thể khẳng định uy quyền trước một loạt những cuộc nổi dậy của dân chúng và nhiều kẻ thách thức quyền lực đối với họ. Hậu quả là một khoảng trống chính trị ở trung ương, trở thành mục tiêu đầy cám dỗ của một nhân vật quân sự đầy quyền lực là Mạc Đăng Dung. Dung là thành viên đầy tham vọng của một thị tộc làm nghề đánh cá, vào thế kỳ XV đã biến thành một dòng dõi văn chương xuất chúng, cho dù họ vẫn còn duy trì mối quan hệ với cái gốc ven biển của họ. Sau khi đạt đến mức cao nhất trong phẩm hàm võ quan ở triều đình, họ Mạc có thể giữ một vị trí nổi bật về mặt quân sự như người đứng ra bảo vệ một triều đình đang suy yếu, trở thành một trong những quyền lực chính trị không ai có thể tranh giành. Năm 1527, Mạc Đăng Dung giữ một địa vị có thể lấn át quyền hành của vua Lê*. Ông ta yêu cầu vua Lê phải giao ngai vàng cho dòng họ Mạc, tuyên bố rằng triều đại nhà Lê đã cáo chung.
Việc nhà Mạc nắm lấy quyền lực ở Thăng Long đưa đến hậu quả là những người còn sống sót cùa triều Lê phải trải qua cảnh sống lưu đày trên đất nước mình, cuối cùng tị nạn ở vương quốc Lào. Ở đó, với sự giúp sức của thành viên hai nhóm quân sự mạnh nhất ở Thanh Hóa, thuộc dòng họ Nguyễn và họ Trịnh, nhà Lê dần lấy lại quyền lực của mình. Nỗ lực này tiếp tục suốt gần thế kỷ XVI, và trong cuộc chiến giằng co và dai dẳng với nhà Mạc, đã nổi lên cuộc tranh đua giữa hai dòng họ được đại diện hỏi hai nhân vật chính là Nguyễn Kim (1467-1545) và Trịnh Kiểm (?- 1570)*. Sự căng thẳng này tăng lên, cho dù hai dòng họ không chỉ đơn thuần là liên minh quân sự, mà còn là sự kết hợp qua hôn nhân. Nguyễn Kim đã gả một trong những cô con gái cho Trịnh Kiểm, buộc chặt hai gia đình theo cung cách được ưa chuộng thời ấy. Tuy nhiên, cả sự liên kết quân sự lẫn hôn nhân không thể ngăn chặn tham vọng cá nhân của Trịnh Kiểm. Trong cuộc tranh giành ưu quyền chính trị, họ Trịnh dần thắng thế, và địa vị được củng cố khi người đứng đầu dòng họ Nguyễn* bị một hàng tướng nhà Mạc mưu sát vào năm 1545*.
Mặc dù lúc đầu hai người con trai của Nguyễn Kim cũng theo cha đi đánh trận để phò giúp nhà Lê, song địa vị của họ so với họ Trịnh đã suy yếu. Nôn nóng tiêu diệt đối thủ của mình, Trịnh Kiểm đã bố trí giết chết người con trai lớn của Nguyễn Kim. Qua hành vi này của anh rể, người con trai nhỏ hơn là Nguyễn Hoàng thấy trước số phận của mình nếu không tìm mưu chước tự bảo vệ. Thông qua người chị ruột là vợ Trịnh Kiểm, ông xin được cử làm Trấn thủ ở các lãnh thổ xa về phía nam là Thuận Hóa và Quảng Nam*. Sự lưu đày phương xa của đối thủ chính trị làm vừa lòng Trịnh Kiểm, ông ta chấp thuận đề nghị của Nguyễn Hoàng. Không lâu sau, vào năm 1558, chàng trai Nguyễn Hoàng 34 tuổi đi vào vùng đất phương Nam, đánh dấu bước khởi đầu sự chia tách về chính trị kéo dài hơn hai thế kỷ, cho đến thời đại của nhà Tây Sơn*. Được sự hỗ trợ bởi thuộc hạ xuất thân từ những gia đình ưu tú đi theo ông vào Nam, lúc bấy giờ hình thành một trung tâm cai trị xuất sắc ở vùng đất mới, Nguyễn Hoàng nhanh chóng xây dựng nên sức mạnh chính trị và kinh tế trên lãnh thổ dưới quyền kiểm soát của ông*.
Việc Nguyễn Hoàng ra đi diễn ra ngay vào lúc họ Trịnh tiếp tục cuộc đấu tranh quân sự chống nhà Mạc, là mối bận tâm của họ cho đến cuối thế kỷ XVI và thế kỷ XVII. Mặc dù theo đuổi mưu đồ chính trị ở phía nam, năm 1593, Nguyễn Hoàng đưa một đoàn quân hùng hậu trở ra Bắc và trải qua suốt bảy năm trời giúp họ Trịnh đạt được thắng lợi quyết định trước nhà Mạc*. Khi họ Trịnh bắt đầu củng cố quyền lực sau chiến thắng nhà Mạc, năm 1600, Nguyễn Hoàng quay về phương Nam, không bao giờ đặt chân trở lại đất Bắc nữa. Một số nhà nghiên cứu lập luận rằng mốc thời gian đó đánh dấu thời điểm rạn vỡ quan trọng giữa hai họ Trịnh-Nguyễn, và từ đó, giữa hai vương quốc độc lập về chính trị*.
Cho dù sự trở lại của Nguyễn Hoàng có là thời điểm quyết định về mối quan hệ giữa hai bên hay không, cái chết của ông vào năm 1613 và sự chuyển giao quyền lực cho người con trai thứ 6 là Nguyễn Phúc Nguyên (1563-1635) rõ ràng đã làm gia tăng bước đi hướng đến sự độc lập của vùng đất phía nam. Năm 1624, sự rạn nứt với phía bắc là không thể hàn gắn khi người con của Nguyễn Hoàng* tuyên bố không chuyển ra Bắc số thuế thu được ở những địa phương mà họ cai quản nhân danh nhà Lê (Trịnh)*. Sự thách thức đó dù là không bất ngờ, cũng bị các chúa Trịnh xem là hành vi bội phản, và dùng nó biện minh cho hành động quân sự của họ.
Năm 1627, họ Trịnh tấn công họ Nguyễn lần đầu tiên, khởi đầu một thời kỳ xung đột kéo dài 45 năm giữa hai dòng họ thù nghịch nhau. Bốn thập niên rưỡi trải qua 6 cuộc xung đột quân sự với qui mô lớn, nhưng không có bên nào chiếm được ưu thế tạm thời so với đối thủ của mình. Dù quân Trịnh có một sức mạnh đáng kể xuất phát từ một dân số đông hơn rất nhiều, song với khả năng chiến đấu của lính bộ và lính biển, quân Nguyễn lợi dụng được địa hình chật hẹp ven biển kết hợp với một loạt thành lũy bảo vệ khiến các cuộc tấn công qui mô lớn của quân Trịnh gặp nhiều khó khăn. Thêm vào đó, cư dân nhà Nguyễn được tổ chức dọc theo các phòng tuyến quân sự, luôn trong tình trạng sẵn sàng chiến đấu. Tình trạng quân đội của chúa Trịnh cũng khá phức tạp do những cuộc tấn công của nhà Mạc còn tiếp diễn. Lực lượng này dù đã phải rời bỏ Thăng Long trong những trận đánh vào cuối thế kỷ XVI, vẫn tiếp tục đe dọa quân Trịnh từ nơi trú ẩn của họ trong vùng rừng núi Cao Bằng, gần biên giới với Trung Quốc. Sau hết, ngoài việc đối đầu với quân chúa Nguyễn ở biên giới phía nam và sự quấy phá của nhà Mạc ở phía bắc, quân Trịnh còn phải đương đầu với sự bất mãn của dân chúng ngay trên lãnh thổ của họ nữa*.
Trong thời kỳ chiến tranh đó, tổ tiên của anh em nhà Tây Sơn đến ngụ cư trên lãnh thổ các chúa Nguyễn. Dòng họ này nguyên sống ở huyện Hưng Nguyên, trấn Nghệ An, trong vùng đất sau này thuộc quyền kiểm soát của chúa Trịnh. Lúc bấy giờ họ mang họ Hồ và theo một vài nguồn sử liệu, họ là cháu trực hệ của Hồ Quý Ly, một võ tướng nổi tiếng vào cuối thế kỷ XIV, đầu thế kỷ XV, người đã nắm lấy quyền bính từ triều đại nhà Trần đã suy yếu (1225-1400) và sau đó cai trị đất nước trong một khoảng thời gian ngắn ngùi trước khi nhà Minh sang xâm lược Đại Việt vào năm 1407*. Giữa những năm 1653 và 1657, trong cao điểm những cuộc giao tranh giữa hai quân đội Trịnh-Nguyễn, ông tổ năm đời của anh em Tây Sơn bị quân nhà Nguyễn cầm giữ và bị buộc phải tái định cư ở vùng Qui Nhơn*. Vào thời đó, Qui Nhơn là một vùng biên khá ổn định, cư dân chính là người Chăm, cùng một số sắc tộc khác không phải là người Kinh. Việc định cư những tù nhân quân sự ở khu vực này là một phần trong nỗ lực của nhà Nguyễn nhằm gia tăng ảnh hưởng của họ trong một vùng quan trọng về mặt chiến lược và cũng có thể nhằm đối phó với những tàn tích còn sót lại trong ảnh hưởng chính trị của vương quốc Chăm trước kia. Thân sinh ba anh em Tây Sơn là ông Nguyễn Văn Phúc tùng có lúc sống ở ấp Kiên Thành trước khi đưa gia đình về làng Tây Sơn*.
Cuộc chiến giữa hai quân đội Trịnh-Nguyễn kéo dài cho đến giữa thế kỷ XVII, bên này mở những cuộc tấn công liên tiếp vào phía bên kia. Năm 1672, quân Trịnh tung ra một loạt tấn công cuối cùng nhằm xâm nhập các phòng tuyến của quân Nguyễn, nhưng tất cả những cuộc tấn công đó đều bị đẩy lùi. Cuối năm đó, quân Trịnh ngưng tấn công và rút về. Cả hai phía chấp nhận một thế bế tắc về quân sự và cuộc ngưng bắn trên thực tế đã hình thành. Tình trạng chiến tranh kết thúc, sự chia tách càng dứt khoát hơn, mỗi bên tiếp tục tự nhận là một vương quốc riêng, dùng con sông Linh Giang* làm ranh giới giữa hai bên. Trong thời kỳ hậu chiến đó, ranh giới này được duy trì chặt chẽ, hai nhà Trịnh-Nguyễn không có những cuộc tiếp xúc trực tiếp với nhau. Tuy nhiên, những cuộc tiếp xúc gián tiếp ở miền Nam Trung Quốc vẫn tiếp tục, thông qua các thương nhân qua lại hai lãnh thổ, giúp cho hai phía ít nhất cũng có những thông tin về nhau.